新工具允许CRISPR-CAS系统PAM的快速ID
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CRISPR-CAS系统被广泛的预示着新一代的遗传工具。但是，这些工具的开发需要研究人员来识别解锁每个系统功能的Prodospacer相邻的主题（PAM）。一套新的技术加快了PAM识别 - 早期测试发现许多CRISPR-CAS系统实际上具有多种不同的强度。
CRISPR-CAS系统保护来自侵略者的细菌，如病毒。它们通过创建匹配特定于给定入侵者特异性的DNA序列的小股线来实现这一点。当那些CRISPR RNA发现匹配时，他们释放蛋白质切碎入侵者的DNA，阻止它复制。然而，该过程中的第一步是没有将RNA与靶DNA进行比较。第一步涉及PAM识别和绑定。
PAM是病毒或其他入侵者的靶DNA附近的短遗传序列。当CRISPR-CAS系统中的蛋白质识别PAM时，该鉴定告诉蛋白质与该DNA结合并开始将相邻的DNA序列与CRISPR RNA进行比较。如果DNA和RNA匹配，则蛋白质切割靶DNA。
“对于研究人员利用用于基因编辑，基因调控或其他技术的CRISPR-CAS系统，您首先需要识别触发特定CRISPR-蛋白组合的相关PAM序列，”追逐助理教授Chase Beisel说NC州立大学的化学和生物分子工程和高级作者一篇描述工作的论文。
“例如，CRISPR-CAS9工具衍生自链球菌Pyogenes与衍生自CISPR-CAS9工具不同的PAM金黄色葡萄球菌“贝塞尔说。“那里有成千上万的潜在克里普尔工具;要利用它们，我们需要一个有效的方法来识别他们的粉斑。我们认为我们已经开发了这样做的工具。“
PAM识别是棘手的，因为难以预测给定CRISPR-CAS系统的PAMS函数函数的函数。并且旨在PAM的遗传序列也很广泛，即使在密切相关的CRAP-System之间也是如此。例如，触发CAS9蛋白的PAMS. pyogenes仅由三个核苷酸组成，但是攻击CAS9蛋白的PAMS.金黄色葡萄球菌含有六个核苷酸 - 没有一个与那些重叠的核苷酸S. pyogenes。
“为了解决这一挑战，我们开发了一个名为Pam-Scanr的工具，”菲塞尔实验室和领导作者上的研究生ryan Leenay说。“PAM-SCANR允许我们识别任何给定的CRISPR-蛋白组合的PAM序列。”
这是PAM-SCANR的工作原理。首先，研究人员从他们想要找到PAM的CRISPR-CAS系统开始。然后在高通量筛网中用作相关的CREPR-蛋白对作为反应性试剂，其同时将CRISPR-蛋白对暴露于许多不同基因序列。基因序列是设计用于点亮的遗传构建体的一部分 - 它们字面意思是荧光 - 当Crispr-蛋白对与它们结合时。如果存在功能PAM，才能发生这种情况。
“让这个工具独特的一件事是它可以用于筛选和识别各种CRISPR-CAS系统的粉浆，”Leenay说。
研究人员在五种CRIP类型中的三种CRAP-CAS系统中测试了PAM-SCARR，该系统依赖于依赖PAM功能。不同的CRISPR类型使用不同的蛋白质并依靠不同的行动机制。
研究人员还开发了一个名为PAM轮的工具，帮助研究人员可视化PAM-Scanr屏幕的输出。它还允许研究人员看看有些Pams是否比其他伙伴更好，并通过多少。
这很重要，因为在测试PAM-SCARR中，研究人员发现，给定的CRISPR-CAS系统可以有多个PAM - 这是一个惊喜 - 并且一些PAMS触发比其他的响应更强大。
“当我们第一次发现帕姆斯近十年前时，我们最初认为只有一个帕姆工作，”NC州食品，生物处理和营养科学系的副教授和一名稿件上的高级作者罗布尔·巴朗努说。“但是，我们的工具显示出一个CASP-CAS系统可以有多个PAM，并且一些PAM比其他议案更好地表现优于识别其目标DNA的CRISPR的一部分。”
研究人员已经使用PAM-ScanR来识别可能是下一代CRISPR工具的CRISPR-CAS系统的PAM。它们还努力确定特定CRAP-CAS系统的不同PAM可能会影响任何给定应用程序的系统的有效性。
“例如，我们想知道PAM之间的可变性是否对基因组编辑的影响以及我们预测偏离目标站点的能力 - 放置CRISPR-CAS系统可能攻击目标DNA以外的攻击，”Beisel说。
本文在3月31日在期刊上发布了“识别和可视化和可视化和可视化功能PAM多样性”分子细胞。本文的共同高级作者是NC州的食品科学副教授Rodolphe Barrangou。本文的领导作者是Ryan Leenay，Ph.D.在NC状态的学生。本文是肯尼斯·麦克斯（Kenneth Maksimchuk）在NC州的前任博士后研究员Kenneth Maksimchuk合作;Rebecca Slotkowski和Roma Agrawal，NC州的本科生;和艾哈迈德·戈马和亚历山德拉博里纳，博士。NC州的学生。该工作得到了国家科学基金会在授权CBET-1403135和MCB-1452902下的支持;并由国家卫生研究院授予5T32GM00876-15。
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编辑注：研究摘要跟随。
“在CRISPR-CAS系统上识别和可视化功能PAM多样性”
作者：Ryan T. Leenay，Kenneth R. Maksimchuk，Rebecca A. Slotkowski，Roma N. Agrawal，Ahmed A. Gomaa，Alexandra E. Briner，Rodolphe Barrangou和Chase L. Beisel，北卡罗来纳州立大学
发表：3月31日，分子细胞
迪伊：10.1016 / j.molcel.2016.02.031
抽象的：Crispr-CAS自适应免疫系统在原核生物中具有多样性的蛋白质家族和作用机制，其中大多数系统依赖于Protospacer相邻的基序（PAM）进行DNA目标识别。在这里，我们开发了一个invivo，正和可调屏幕称为由非栅极抑制所实现的PAM屏幕的可调谐屏幕，以阐明功能性PAM以及被称为PAM滚轮的交互式可视化方案来传达单个PAM序列及其活动。。PAM-SCANR和PAM滚轮确定了已知的功能PAM，同时揭示了复杂的序列活动景观Bacillus halodurans.I-C（级联），大肠杆菌I-E（级联），嗜热链球菌ii-a crisp1（cas9），和Francisella诺维利达V-A（CPF1）系统。PAM轮也很容易适用于现有的高吞吐量屏幕，并加入SPYCAS9和SAUCAS9 PAM多样性的洞察力。这些工具提供了强大的方法，阐明和可视化功能拟议，以加速我们理解和利用本质上众多CRISPR-CAS系统的能力。
